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| accueil | immun 1-05: Techniques d'analyse de la réponse anticorps (sérologie); variations inter-spécifiques des Ig |
<-- cours --> |
objectifs pédagogiques (*) ------------------courte Présentation du cours immun04 YouTube--------------------- |
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- lister les prélèvements vétérinaires utilisables pour les études immunologiques; définir sérum et plasma; lister les principaux constituants; décrire les modalités d'obtention et les avantages et inconvénients | |
définitions générales - messages |
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| sérologie | = terme usuel pour désigner l'étude des anticorps à partir du sérum. |
| sérum | = liquide résultant de la coagulation du sang (prélèvement sur tube sec) ( fig1: diférence sérum plasma) |
| plasma | = liquide dans lequel baignent les éléments figurés du sang (hématies, leucocytes et plaquettes). Le plasma représente environ 50% du volume sanguin. On trouve dans le plasma de nombreuses protéines.( fig1: diférence sérum plasma) |
| "conjugué" | =complexe moléculaire artificiel (produit en laboratoire), créé par liaison covalente entre un élément détectable/mesurable, et un élément de reconnaissance qui est capable de se fixer sur l'élément recherché (antigène si on recherche l'anticorps ou réciproquement..). On peut parler d'immun-conjugué pour préciser qu'il s'agit d'un complexe entre un anticorps et un élément détectable. |
| techniques sérologiques | On peut regrouper schématiquement les techniques sérologiques selon plusieurs critères: - méthodes directes (recherche d'antigènes) ou indirectes (recherche d'anticorps) - techniques primaires (observation de la réaction Ag-Ac: agglutination..), secondaires (observation des fonctions biologiques des anticorps: neutralisation virale..), tertiaires: ELISA, IFI..). |
| Il existe de très nombreuses applications médicales et non médicales des techniques utilisant des anticorps. Ces techniques très répandues et souvent peu couteuses nécessitent cependant une mise au point sophistiquée et une interprétation soigneuse (qualité, sensibilité, spécificité..). | |
| variations interspécifiques des Ig | La structure des Ig est globalement conservée chez les vertébrés, mais il existe des différences isotypiques notables: - les gènes, et donc les séquences protéiques des domaines constants des Ig, varient d'une espèce à l'autre: les Ig d'une espèce peuvent donner lieu à une réponse anticorps contre les épitopes discordants. Les Ig d’une espèce sont considérés aussi comme des Ag : réponse Ac par immunisation interspécifique (utilité : obtention de réactifs /diagnostic) - toutes les classes et sous-classes ne sont pas équivalentes dans les différents ordres des vertébrés: les propriétés physico-chimiques et biologiques des Ig des différentes classes varient d'une espèce à l'autre (cf cours immun2-01: immunologie comparée). |
| chromatographie d'affinité | = procédé de purification basé sur l'affinité d'un ligand spécifique (fixé sur un support) pour une molécule (présent dans une solution): on utilise souvent comme ligand un anticorps . L'anticorps retient l'antigène sur le support durant le passage de la solution (à pH neutre), puis le relâche dans l'éluat lorsqu'on déplace l'équilibre de la réaction antigène-anticorps (à pH acide). (fig13 : principe de la purification par affinité) |
| protéine A | = une des protéines de la paroi des staphylocoques (cf cours de microbiologie), qui a la capacité de fixer l'albumine et les IgG (sur la partie Fc): la bactérie se cache ainsi derrière les protéines de l'individu et échappe à la réponse immune (limite l'opsonisation..). On utilise différents variants recombinants de la proteine A au laboratoire pour fixer les Ig des différentes classes (fig14: exemples d'application de la protéine A): - pour purifier les Ig par affinité sur une colonne de chromatographie (billes recouvertes de proteine A). - pour fabriquer des conjugués anti Ig (couplage protéine A-élément détectable). |
schémas et figures |
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tableaux |
tableau 1: techniques sérologiques |
objectif |
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| dosage des Ig | Mesurer la quantité totale d'Ig (toutes classes ou une classe/sous classe donnée) pour vérifier qu'elle est normale: - déficit immunitaire (réduction ou absence) - transfert de l'immunité maternelle (veau, poulain..) - tumeur lymphocytaire B: sécrétion anormale d'un pic d'Ig |
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| diagnostic/dépistage des infections/parasitoses | - diagnostic = identiffier la cause d'une maladie (symptômes) - dépistage = rechercher un problème asymptômatique (infection/parasitose : portage sain, incubation..) |
2 principes : | direct | Rechercher un Ag (ou tout autre élément caractéristique) : ex leucose féline - avantage : la présence d' Ag permet de confirmer une iinfection/parasitose en cours (non résolue) - inconvénient : le prélèvement doit contenir une quantité d'Ag suffisante (peu d'infections/parasitoses se manifestent pas une antigénémie constante) |
| indirect | Rechercher des Ac (ou tout autre réponse de l'organisme caractéristique) : ex la plupart des tests de dépistage des infections - avantage : la présence d' Ac est fréquente durant les infections/parasitoses - inconvénient : l'interprétation est délicate (non synchronisation entre la réponse anticorps et l'infection; risque de réactions croisées ou d'interférence avec la vaccination ou l'immunité maternelle). |
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| dosages hormonaux.. | Utiliser des anticorps pour mesurer la quantité d'un facteur sérique (ou plasmatique) donné | |||
tableau 2: principales techniques sérologiques |
primaires |
secondaires |
tertiaires |
| principe | observation directe de la réaction antigène-anticorps | observation de fonctions biologiques résultant de la réaction antigène-anticors | création d'un complexe détectable entre l'élément recherché (antigène ou anticorps) et un conjugué; le complexe est détecté par fixation sur un support (puit, lame histologique, papier de chromatographie, billes..). |
| exemples | agglutination (identification des groupes sanguins..) (fig3: exemples) | neutralisation (séroneutralisation virale..) (fig3: exemples) | ELISA (fig6 et 8), IFI (fig7 et10), Immunochromatographie (fig11), Western-blot (fig12).. Billes recouvertes d'Ag (Multiplex et variantes) |
| précipitation (très nombreuses techniques) (fig4: SRID= single radial immunodiffusion = technique de Mancini: précipitation en cercle, à partir d'un puit contenant un Ag, dans un gel contenant un anticorps) | fixation du complément (fig5) | ||
| inhibition de l'hémagglutination (possible pour détecter des agents infectieux agglutinants: virus grippaux..) | |||
| avantages | facilité de mise en oeuvre | forte sensibilité (µg/ml) | très forte sensibilité (pg-ng/ml); très nombreuses variantes appliquées à tous les cas de figure (recherche d'Ag, recherche d'Ac, compétition..) techniques ±spécialisées et ±automatisables (complexité et coût élevé de mise au point) |
| inconvénients | faible sensibilité: 100 µg/ml (sauf techniques modernes utilisant des appareils de détection très sophistiqués) | difficulté de mise en oeuvre nécessitant le recours à un laboratoire spécialisé |
tableau 2: élément détectable utilisé dans le conjugué |
exemples | avantages | inconvénients |
| radio-isotope (cpm) | nombreuses techniques en recherche et en médecine nucléaire (immunoprécipitation, scintigraphie..) | ||
| Radio-immunologie (RIA) | très sensible (pg/ml) ; permet des dosages | danger, complexité | |
| fluorochrome (couleur apparaissant par excitation UV) | immuno-fluorescence sur lame microscopique | très sensible; permet une analyse détaillée qualitative sur coupe tissulaire | complexité |
| immuno-fluorescence sur plaque (technique similaire à l'ELISA) ou billes | très sensible; application aux automates (Luminex®...) | coût élevé de mise au point | |
| colloïde d'or (couleur apparaissant par formation d'un réticule entre molécules de conjugué adjacentes: cf wikipedia) | immunomarquage en microscopie électronique | très sensible; permet une analyse détaillée à l'échelle cellulaire | complexité (applications en recherche) |
| immunochromatographie | simple: nombreux "doctor's tests" | quantification impossible | |
| enzyme (couleur apparaissant par oxydation d'un substrat; le substrat oxydé peut-être soluble ou insoluble: coloration uniforme du test ou dépot de la coloration au site de fixation du conjugué) | ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) (substrat soluble) | très nombreuses variantes (du "doctor's test" à l'automate de plaques) | coût élevé de mise au point |
| dot-blot (substrat insoluble) | simple: nombreux "doctor's tests" | quantification difficile | |
| Western-blot (substrat insoluble) | sensible; permet une analyse détaillée à partir d'un mélange d'antigènes (séparation préliminaire des antigènes par électrophorèse) | complexité (applications en recherche) | |
élements d'application et de raisonnement |
| la plupart des techniques en immunologie sont "réversibles": on peut rechercher l'antigène dans un prélèvement si le laboratoire dispose de l'anticorps (diagnostic direct, cf, fig2: exemples), ou on peut rechercher la réponse anticorps dans un prélèvement si le laboratoire dispose de l'antigène (diagnostic indirect , fig3: exemples), En prenant l'example de l'ELISA: - diagnostic direct : un anticorps est fixé sur le support (pour capturer l'antigène présent dans le prélèvement) - diagnostic indirect : un antigène est fixé sur le support (pour capturer les anticorps présents dans le prélèvement) Il existe de très nombreuses applications des techniques immunologiques basées sur la reconnaissance d'antigènes : - un antigène microbien/parasitaire : diagnostic ou dépistage d'infections - toute autre protéine d'intérêt : hormone (dosage pour le diagnostic des maladies endocrines et le contrôle du dopage..), contaminant.. |
| Les Ig présentent des variations interspécifiques importantes structurales et fonctionnelles (isotypes). Ceci a des conséquences sur le fonctionnement de l'immunité dans chaque espèce (réponse à la vaccination..). Les IgG(T) du cheval sont un exemple de particularité spécifique. Par ailleurs ces variations ont des conséquences sur les techniques vétérinaires: - Les Ig sont considérés comme des antigènes étrangers quand ils sont transférés entre 2 espèces distinctes: leur immunogénicité provoque l'apparition d'anticorps anti-Ig qui reconnaissent les éléments dissemblables (domaines constants de la partie Fc..). Ceci est la base de création d'outils d'étude des Ig. - Le transfert des Ig d'une espèce à l'autre s'accompagne généralement d'une perte d'une partie des fonctions (selon la capacité de fixation aux RFc de l'espèce receveuse.). - Le transfert régulier d'Ig entre espèces n'est pas possible (mise en place d'anticorps anti-Ig qui inhibent l'activité ou provoquent un rejet). Cf cours sur la sérothérapie (immun2-09) Considérations identiques en ce qui concerne les autres protéines de l'immunité (cytokines, facteurs du complément..) |
| Pour étudier les anticorps dans une espèce donnée, il est souvent nécessaire d'utiliser un conjugué anti-Ig de cette espèce (fig9: principe d'obtention d'un réactif anti Ig de chat). Ainsi l'injection d'IgG bovines à un lapin lui fait produire des anticorps anti IgG bovines (qui reconnaissent les éléments caractéristiques de l'espèce bovine sur les domaines constants des chaines H et L): les anticorps purifiés anti-IgG bovines servent à fabriquer un conjugué utilisable dans de nombreuses trousses de diagnostic indirect des maladies des bovins. Les laboratoires produisent et commercialisent de nombreux conjugués utilisables en recherche et en médecine vétérinaire. |
| Les outils immunologiques sont aussi utilisés dans de très nombreux domaines non-médicaux, par exemple dans la recherche (caractérisation et purification de molécules), l'agro-alimentaire (recherche de fraudes: détection de lait de vache dans un fromage "pur chèvre"..) |
| Pour chaque diagnostic, il existe souvent plusieurs possibilités techniques, qui ont chacune leurs avantages et leurs inconvénients: le praticien doit choisir la plus adaptée à ses besoins médicaux (spécificité/sensibilité, fiabilité..) et ses contraintes pratiques (délai de réponse, coût). |
- comment fabriquer un conjugé anti-IgG de lapin pour un ELISA ?
- quel est l'intérêt de la proteine A par rapport à un anticorps anti-Ig?
- reproduire sur un schéma les étapes de la réalisation d'un test immunologique (ex: ELISA par compétition pour le diagnostic indirect de la brucellose bovine).
| cf TPimm | principales techniques sérologiques utilisées en médecine vétérinaire |
références et cours disponibles |
Techniques d'obtention de sérum et de plasma: cf cours de biochimie (types d'anticoagulants et de tubes..).
pour en savoir plus :
- variantes des techniques immunoenzymatiques: http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/lafont/dosages/D3.html
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exemple TP (dosage ELISA d'anticorps de lapin anti BSA): http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/ATP/immu6el2.htm
page réalisée par le Dr Delphine Grézel, VetAgro Sup, Campus Vétérinaire de Lyon, le 1/02/13 . Merci pour les corrections, commentaires et suggestions (delphine.grezel@vetagro-sup.fr)