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immun2-11: Principes d'analyse de l'immunité- interprétation des tests; immunité comparée des vertébrés

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objectifs pédagogiques (*)

- comparer les principes de l'étude globale de l'immunité et de l'étude de l'immunité spécifique.
- citer quelques exemples et lister les avantages et inconvénients de diagnostic direct et indirect.
- utiliser les paramètres de l'interprétation et de la quantification des tests imunologiques (témoins, seuils, titres, index..); citer les principales erreurs possibles. (tableau2: quantification, tableau3: erreurs d'interprétation) (cf Travaux Pratiques: TP imm)
- décrire les principales caractéristiques de l'immunité des invertébrés, des poissons, des amphibiens et reptiles, des oiseaux et des mammifères.

définitions générales - messages

diagnostic = recherche de la cause de symptômes. Le diagnostic clinique (symptômes + lésions +commémoratifs..) peut être complété par de nombreux examens complémentaires (imagerie, biochimie, microbiologie-parasitologie, immunologie, histologie..). (cf tableau1: différentes approches du diagnostic immunologique).
Au sens large, le diagnostic englobe aussi le dépistage (le dépistage étant la recherche d'une contamination en l'absence de syptômes: cf immun2-12).
Il existe de très nombreuses techniques immunologiques appliquées au diagnostic:
- des techniques visant à vérifier le bon fonctionnement du système immunitaire ou à donner des indications pathologiques générales (examen des ganglions, numération-formule leucocytaire, dosage des Ig totales..)
- les méthodes de diagnostic/dépistage des infections et parasitoses
- des techniques biochimiques ou histologiques qui utilisent des anticorps pour rechercher/doser la présence d'une molécule donnée dans un prélèvement (reproduction: dosage de progesterone, cancérologie: identification du type tumoral..)
Le choix d’un test immunologique plutôt qu’un test microbiologique ou génétique (PCR..) doit se décider au cas par cas, selon la dynamique et la fiabilité de la réponse immune infectieuse/parasitaire.
fig1a : cinétique retardée des anticorps lors d’une infection aigue (hépatite A) ou au contraire fig1b: précoce lors d’une infection chronique (FIV : paramètres sanguins au cours des mois post contamination)
  fig2 : fiabilité d’un test basé sur les anticorps (risque d’erreur par défaut d’anticorps, par réaction croisée..)
Schématiquement, on peut distinguer 2 méthodes de techniques de diagnostic des infections et parasitoses (cf immun2-12):
- méthodes directes: mise en évidence du µorganisme/parasite ou de constituants caractéristiques (ADN, antigènes..). (fig3: exemples de techniques de diagnostic direct, fig4: exemples de techniques immunologiques appliquées à l'identification microbienne en culture,
- méthodes indirectes: mise en évidence d'une réponse caractéristique à l'infection/parasitose (réponse anticorps..) fig 5: exemples de techniques de diagnostic indirect)
titre = inverse de la dernière dilution ayant donné un résultat positif dans un test (par dilution sérielle d'un échantillon). Le titre fournit une mesure semi-quantitative. (fig6: exemple de détermination du titre dans la technique de fixation du complément par dilutions successives de l'échantillon)
extrapolation / gamme = méthode de mesure quantitative de la valeur de l'échantillon testé en fonction de son résultat, par extrapolation à partir de résultats obtenus dans le même système technique avec des echantillons de valeur connue (gamme). (fig7: exemple d'extrapolation graphique d'une concentration à partir d'un test ELISA).
immunologie comparée = étude des particularités spécifiques de l'immunité et de l'évolution phylogénétique du système immunitaire (cf tableau4: principales caractéristiques de l'immunité des vertébrés) .
Ces études sont importantes à plusieurs titres:
- pour accroitre les connaissances fondamentales, en particulier en comparant des "options" prises par différentes espèces (particularités des lymphocytes des ruminants et des porcins, particularités du drainage lymphatique des porcins..)
- pour adapter les méthodes de diagnostic et les vaccins en médecine vétérinaire (production de réactifs adaptés aux espèces, particularités de la vaccination des oiseaux et poissons..).

schémas et figures

1a 1bfiv 2 3 4 56 7

tableaux

tableau 1: différentes approches diagnostiques en immunologie

évaluation du fonctionnement immun global
évaluation de la réponse immune spécifique
diagnostic indirect des infections
diagnostic direct
principe
analyser le fonctionnement normal ou rechercher un dysfonctionnement de l'immunité (déficit, tumeur, allergie, maladie auto-immune..)
recherche d'une réponse immune spécifique
recherche d'antigènes
exemples
- dosage d'Ig (sérum, colostrum..)
- recherche d'anomalies des Ig (electrophorèse es protéines plasmatiques..)
- numération-formule sanguine (nombre et aspect des leucocytes)
- palpation/radiographie des ganglions
- étude des composantes non spécifiques (fièvre/inflammation, complément (dosage, électrophorèse des protéines plasmatiques..)
- recherche de lésions auto-immunes (dépots d'anticorps: immunohistochimie..)
- sérologie des maladies infectieuses (=recherche des anticorps sériques)
- exposition contrôlée in vivo à un antigène (IDR tuberculinique, tests allergèniques..)
- détection d'antigènes microbiens ou parasitaires dans un prélèvement (sérum, fécès..)
- détection d'antigènes microbiens ou parasitaires par immunofluorescence sur une coupe tissulaire
- détection d'antigènes tumoraux solubles ou cellulaires; identification d'un phénotype tumoral (expression des CD membranaires)

tableau 2: quantification des techniques en immunologie

qualitative
semi-quantitative (valeur relative)
quantitative (valeur absolue)
expression du résultat positif/négatif valeur relative (ordre de grandeur, index..) qu'on peut comparer à un témoin/seuil d'interprétation de la technique valeur absolue (mg/ml, UCEE/ml, UI..) qu'on peut interpréter quelle que soit la technique
technique de mesure

2 types d'observation selon les techniques:
- résultat global (- ou +)
- analyse détaillée (ex: structures cellulaires colorées dans un test immunohistohimique..)

observation subjective de l'intensité de réaction (- à +++) méthode de titration: le même échantillon est testé à différentes dilutions (donc à des concentrations décroissantes de la substance recherchée), et on obtient une série de résultats observés.
résultat mesurable (chiffré)
extrapolation par comparaison des résultats de l'échantillon et d'une gamme "étalon" (courbe de calibration donnant en tout point une équivalence entre la mesure et la concentration de la substance recherchée)
résultat brut (densité optique, comptage de la radioactivité..) index= système d'expression du résultat qui tient compte des variations expérimentales, et permet la comparaison entre différentes séries de tests. Le résultat de l'échantillon est calculé par une formule qui tient compte des témoins index=100*(valeur brute TP-valeur brute E)/(valeur brute E-valeur brute TN).
transformation possible non on peut transformer un résultat qualitatif en un résultat relatif par la méthode de titration: Le titre est l'inverse de la dernière dilution ayant donné un résultat positif on peut transformer un résultat relatif en un résultat absolu si on compare l'échantillon testé à une référence dont le résultat est connu dans les 2 systèmes. Toutefois il s'agit d'un résultat peu précis (échelle de transformation discontinue). exemple:
- l'échantillon testé obtient le titre 32 (dilution sérielle de 2 en 2: dernier résultat positif à la dilution 1/32)
- le sérum de référence (concentration connue de 20 mg/ml d'anticorps) obtient le titre 64
- donc l'échantillon contient 2 fois moins d'anticorps que le sérum de référence, soit 10mg/ml
paramètres d'interprétation (témoins ou seuils) témoin de validité: valeur attendue d'un contrôle interne fourni avec le test (exemple: le témoin positif "doit être coloré" ou "doit présenter une DO≥0,6"..). Le test ne peut pas être interprété si le témoin de validité ne donne pas le résultat escompté (test périmé, erreur de réalisation..).
Les tests sont généralement réalisés en duplicate (2 tests par échantillon): un résultat n'est valide que si les 2 valeurs diffèrent de moins de 10-15%.
témoins d'interprétation (+ et -) : valeurs moyennes prises par des échantillons positif et négatif (ces témoins permettent de calculer les index).
Les témoins d'interprétation peuvent servir en même temps de témoins de validité.
seuil de positivité: valeur minimale que peut prendre un échantillon considéré positif.
Les tests les plus précis utilisent à la fois un seuil positif et un seuil négatif: les résultats sont positifs au delà du seuil de positivité, négatifs en dessous du seuil de négativité, "non interprétables" entre ces 2 seuils. Lorsque le résultat n'est pas interprétable, on considère l'animal suspect, et il est nécessaire de recourir à une autre méthode de test ou de refaire une analyse 1 à 2 semaines plus tard.

 


tableau 3: erreurs et critères de fiabilité du test

résultat du test: négatif résultat du test: positif causes d'erreurs fréquentes pour un test sérologique: (fig5: faux positifs et faux négatifs déterminés en fonction du seuil de positivité d'une technique)
état réel de l'animal (preuve clinique ou technique de référence) indemne VN FP (erreur par excès) présence d'anticorps interférents (immunité maternelle, vaccination..), test peu spécifique (réaction croisée avec d'autres µorganismes)
infecté FN (erreur par défaut) VP test trop précoce (incubation), test peu sensible..

2 paramètres de la qualité d'un test: sensibilité: détecter le maximum d'individus parmi les malades =VP /(FN+VP) et spécificité: détecter le minimum d'individus indemnes =VN /(FP +VN)



tableau 4: principales caractéristiques de l'immunité des :

organes et cellules Ig autres
invertébrés pas d'immunité spécifique; nombreux mécanismes non spécifiques (y compris phagocytose)
poissons organes lymphoïdes moins structurés que les mammifères (absence de noeuds lymphatiques..) 2 classes d'Ig (pas de réponse secondaire ss mais simple amplification en cas de ré-exposition) activité immune saisonnière (en rapport avec la poikilothermie) : minimum lors de l'hibernation, en relation avec le taux de corticoïdes
rejet de greffes: mécanismes lents
amphibiens 2 classes d'Ig (pas de réponse secondaire ss mais simple amplification en cas de ré-exposition)
reptiles (distinguer sauriens, ophidiens et tortues!) 2 ou 3 classes d'Ig (réponse secondaire possible mais frustre)
oiseaux (distinguer selon groupes) - organe dévolu à la production des lymphocytes B= Bourse de Fabricius
- absence de noeuds lymphatiques (mécanismes d'interactions différents des mammifères)
- populations granulocytaires différentes des mammifères (hétérophiles..) 		3 classes d'Ig (IgM, IgA, IgY) ; réponse secondaire possible
mécanismes de production des Ig différents de ceux des mammifères 		utilisation des IgY en recherche; transfert de l'immunité maternelle dans l'oeuf
mammifères - variations interspécifiques dans la structure et le fonctionnement des plaques de Peyer et des noeuds lymphatiques
- variations interspécifiques dans la nature et les propriétés des sous-populations lymphocytaires 		5 classes d'Ig; variations interspécifiques dans la nature et les propriétés des classes et sous-classes d'Ig mécanismes d'histocompatibilité complexes; transfert de l'immunité maternelle

élements d'application et de raisonnement

Les causes d'erreur sont nombreuses lorsqu'on utilise des tests immunologiques. Les méthodes directes ont l'intérêt d'apporter une certitude sur l'existence d'une infection en cours quand ils sont positifs (tandis que la présence d'anticorps peut durer après l'élimination de l'infection). (tableau3:erreurs)
Par exemple les causes d'erreur d'un test sérologique indirect sont:
- test non adapté (utilisation hétérospécifique..), faible spécificité ou faible sensibilité
- test de mauvaise qualité ou non interprétable (erreur de réalisation, test périmé ou mal conservé..)
- erreurs par défaut liés à une faible réponse immune de l'animal (incubation..)= "faux-négatifs" ( fig1: exemple d'évolution de la réponse anticorps au cours d'une infection aigüe)
- erreurs par excès liés à des interférences avec des anticorps provenant d'une autre cause que l'infection (réactions croisées, persistance de l'immunité maternelle chez un jeune < 3 mois, anticorps issus d'une vaccination..) ="faux-positifs"
La quantification d'un test n'est pas toujours nécessaire (tableau2: quantification). Toutefois la quantification permet l'analyse de l'évolution de la réponse anticorps dans le temps (comparaison des taux à 2-3 semaines d'intervalle), ou la comparaison à un seuil de positivité, et peut être utile pour décider dans les cas douteux (fig5: principes de la quantification d'un test et de l'établissement de seuils pour limiter les risques d'erreur).
L'immunologie comparée est importante pour les vétérinaires:
- elle permet d'interpréter de façon juste les similitudes et les différences du fonctionnement normal ou pathologique de l'immunité selon l'espèce à laquelle on a affaire, en limitant les erreurs d'extrapolation à partir données générales connues chez l'homme ou la souris.
- elle permet de mettre au point des outils thérapeutiques adaptés (vaccins efficaces chez les oiseaux ou les poissons, réactifs pour l'analyse de l'immunité des animaux sauvages, cytokines à utilisation vétérinaire...).
- elle apporte des informations sur la biodiversité et l'évolution des espèces.

- la recherche de leishmanies chez le chien, par immunofluorescence sur un frottis de moelle osseuse est elle une technique directe ou indirecte?
- faire un schéma représentant les différents temps de l'infection, de la maladie et de la réponse anticorps
- étudier sur quelques exemples les avantages et inconvénients des techniques de diagnostic direct et indirect en immunologie? est ce que les techniques directes sont plus rapides à réaliser que les techniques indirectes? idem..des différentes techniques tertiaires.
- imaginer le principe d'un test semi-quantitatif par titration en inhibition de l'hémagglutination (diagnostic de la grippe)

références et cours disponibles

pour en savoir plus: cf Travaux Pratiques: TP imm

page réalisée par le Dr Delphine Grézel, VetAgro Sup, Campus Vétérinaire de Lyon, le 9/12/09 . Merci pour les corrections, commentaires et suggestions ( delphine.grezel@vetagro-sup.fr)