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S6 TPimm: travaux pratiques en immunologie

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objectifs pédagogiques (*)

- être capable d'utiliser et d'interpréter des trousses de diagnostic immunologiques commerciales
- connaitre les principes de réalisation et les avantages et inconvénients des techniques courantes en médecine vétérinaire
cf cours sur les techniques de diagnostic: immun1-05 et tableaux sur l'interprétation des tests

2 séances: TPimm1 et TPimm2

  séance 1 (présentation + 2h) séance 2 (3h)
dosage des IgG dans un sérum bovin par immunoprécipitation (SRID, Mancini): kit SRID IDBiotech® dépot des gammes et sérums sur la plaque d'agarose contenant un anti-Ig bovines lecture et interprétation
dot-blot de comparaison de conjugués capables de fixer les Ig préparer les 3 membranes de nitrocellulose dans les boites de Petri (conserver fermé à température ambiante) réalisation du dot-blot et interprétation
test de dépistage des infections bovines par une technique ELISA (trousse commerciale)

mise en route (dépot des sérums et incubation sur la nuit à 4°C)
3 trousses différentes sont utilisées pour montrer les principes d'un test indirect classique, d'un test direct, d'un test par compétition et ou d'un test avec adsoprtion préalable.

suite: (lavages, conjugué, lavages), dépôt substrat et solution d'arrêt, lecture DO, et interprétation
test sérologique par immunochromatographie en pratique courante: trousse rapide SpeedDuo FeLV/FIV BVT-VIRBAC ® réalisation complète (2 tests par groupe de TP)  
dosage biochimique des Ig dans un sérum bovin: kit BOVA-S VMRD® réalisation complète (1 test par groupe de TP)  
test sérologique de la brucellose par agglutination (test RoseBengale Institut Pourquier®) démonstration à l'une ou l'autre séance selon temps disponible
  préparation du compte rendu de groupe rendu du CR de TP + 30' examen (questions sur les TP et les 5 premières heures de cours)
3 tests ELISA différents sont utilisés pendant la séance, afin de comparer les principes de l'ELISA indirect classique, par compétition ou par épuisement préalable.

organisation pratique pour chaque binôme

  tests à réaliser résultats à fournir: Le groupe interprète les résultats et rédige un compte-rendu commun en séance
binome 1 ELISA 1

- tableau récapitulatif des résultats ELISA obtenus avec chaque kit par binome (principe et schéma de l'ELISA, résultats bruts, validation des témoins, interprétation, commentaires..)
- graphe SRID (lecture par tous les binomes) et valeurs des sérums en mg/ml d'Ig; interprétation du BOVA-S
- interprétation sous forme de tableau du dot-blot
- schémas descriptifs des tests réalisés (principe des ELISA, du dot-blot et de l'immunochromatographie)
binome 2 ELISA 1
binome 3 ELISA 2
binome 4 ELISA 2
binome 5 ELISA 3
binome 6 ELISA 3
L'ensemble du groupe s'organise (2 binomes sont chargés de vérifier que tous les tests sont réalisés dans les temps et que tous contribuent à la rédaction du compte-rendu).
Les étudiants se lavent les mains avant et après la séance, et travaillent en blouse. Les groupes de TP se répartissent en 6 binomes/trinomes, et s'organisent pour réaliser les tests avec le matériel et les échantillons fournis. Un frigidaire à 4°C et une étuve sèche à 37°C sont disponibles dans la salle. Les tests, leurs notices et les matériels nécessaires (pipettes réglables et cones, tubes..) sont en libre-accès; de même pour les solutions de lavage et de dilution (prêtes à l'emploi). Les lavages des plaques ELISA se font par aspiration (trompes à vide) et remplissage à la pissette.
La lecture ELISA se fait en fin de séance 2 en regroupant les barettes quand l'ensemble du groupe a terminé (bichromatisme 450-630nm ou monochromatism 450nm selon les tests).
Les réactifs et les sérums à tester (identification par un n° variant selon le selon groupe TP: se référer à la liste fournie en séance1) sont conservés à 4°C dans un portoir réfrigéré (et doivent y être replacés très soigneusement après chaque utilisation!). Il s'agit de sérums individuels, fournis purs (à diluer selon les indications du test).

protocole ELISA (plusieurs types: test indirect classique, par compétition, avec épuisement préalable..): réalisation selon notice du kit fournie par le fabriquant (Synbiotics®, Pourquier® ou LSI®...) ; protocole "long"

  puit A puit B puit C puit D puit E puit F puit G puit H
colonne 1 N P bovin 1 bovin 2 bovin 2 dilué au 1/10 bovin 3 bovin 4 bovin 4
colonne 2 N P bovin 1 bovin 2 bovin 2 dilué au 1/10 bovin 3 bovin 4 bovin 4
étape conjugué oui oui oui oui oui oui oui non (diluant)
Calculs et interprétation à l'aide d'un tableur Excel


protocole Immunodiffusion en Gélose SRID - Immunocheck IgG bovines VMRD® (fournisseur LSI) : dosage des IgG dans un sérum bovin pour dépistage d'un défaut de transfert passif de l'immunité chez le veau

Le groupe de TP utilise en tout 6 puits sur une plaque d'immunodiffusion (puits préformés dans une gélose contenant un antisérum polyclonal anti IgG bovines). identifier la plaque (nom du groupe au marqueur sur le rebord), déposer délicatement 3µl dans chaque puit. Réaliser et interpréter selon le protocole fourni par le fabriquant (extrapolation graphique). Exprimer le résultat en mg/ml.
- gamme 3200 mg/dl
- gamme 1600 mg/ dl
- gamme 800 mg/dl
- gamme 400 mg/dl
- sérum veau A (n° selon groupe TP)
- sérum veau B (n° selon groupe TP)

protocole Immunochromatographie: SpeedDuo FELV/FIV (VIRBAC®) ou recherche des agents de diarhées néonatales bovines (VIRBAC®)

Selon le kit, dépistage des 2 rétrovirus félins par immunochromatographie dans les sérums félins ou diagnostic d'une diarhée bovine avec les échantillons (n° selon groupe TP) . Réaliser et interpréter selon le protocole fourni par le fabriquant. Faire le schéma descriptif du principe du test (recherche d'Ag)..

protocole dosage biochimique de dosage des Ig (BOVA-S VMRD®)

analyse avec les sérums de veau A et B (n° selon groupe TP). Réaliser et interpréter selon le protocole fourni par le fabriquant, avec l'aide de 2 tests préparés lors de la première séance (sérum "seuil" environ 6mg/ml IgG bovines et sérum bovin adulte >20 mg/ml Ig). Attention: ne pas mettre les doigs ni écrire sur le verre (tenir par le bouchon et écrire le n°test sur l'étiquette).

protocole dépistage de la brucellose par agglutination (test Rose Bengale®)

démonstration: On utilise un réactif constitué d'une suspension de Brucella abortus (tuées et agglomérées par un procédé chaleur/formol qui ne dénature pas la surface bactérienne), dans un tampon coloré à pH légèrement acide (pour limiter les réactions artefactuelles). Différents sérums de ruminants sont mis en présence d'une quantité équivalente de bactéries en suspension (30µl) dans des cupules, sous agitation douce pendant 3mn. On effectue une lecture optique de l'agglutination (diagnostic indirect).

protocole dot-blot: comparaison de la capacité de 3 conjugués à reconnaitre des IgG de différentes espèces

étape 1 (3 membranes A, B, C):
- pour chaque membrane: découper un morceau de nitrocellulose de 4x4 cm sans le toucher avec les doigts (ciseau/pince); faire une encoche en haut à gauche de la membrane; déposer la membrane dans une boite de Petri, identifier chaque membrane par A, B ou C au marqueur sur le rebord de la boite.
- dépot des 6 échantillons de sérum de différentes espèces sur les 3membranes de nitrocellulose: déposer 3µl de chaque sérum avec une micropipette, en séparant bien les gouttes (diffusion ±). Attention à bien réperer l'emplacement des sérums (faire schéma de la membrane) pour faire l'interprétation par la suite. Laisser sécher 15mn à 37°C: sérum bovin normal, sérum de veau foetal, veau A, veau B, chèvre, mouton, mouflon, cheval, souris ou rat, lapin, chien, poule ou canard.

étape 2 (une fois que les taches de sérum sont sèches) :
- saturation de la membrane par 5ml d'une solution concentrée (tampon Tris, 5% Tween20) pendant 15mn sous agitation puis vider la boite à la trompe à vide, rincer 1mn avec 10ml de solution DotSol (PBS ph7.4 avec 0,05% Tween20) et laisser sécher 10mn à 37°C.

étape 3: lavage avec DotSol (déposer à la "pasteurette" 3ml sous agitation pendant 1mn et vider à la trompe à vide), puis dépot sur les membranes correspondantes des conjugués A (proteine A-phosphatase alcaline à diluer dans DotSol au 1/10 qsp 5ml), B (rabbit Ab anti bovine IgG-phosphatase alcaline à diluer dans DotSol au 1/50 qsp 5ml) et C (mAb anti bovine IgG-phosphatase alcaline à diluer dans DotSol au 1/50 qsp 5ml). Laisser incuber pendant 15mn sous agitation à température ambiante. Attention: les conjugués sont préparés et prédilués en début de séance au 1/500 dans DotSol par l'enseignant.

étape 4: lavage DotSol 3 fois (à chaque fois mettre 3ml sous agitation pendant 1mn et vider à la trompe à vide), rincer 1mn avec de l'eau physiologique, dépot de 3ml de substrat BCIP/NBT avec une "pasteurette" dans chaque boite sous agitation manuelle- arrêt par rinçage à l'eau du robinet après 1-5mn de révélation (contrôler selon l'intensité de coloration des échantillons /bruit de fond)

Utiliser un agitateur automatique pour les étapes d'incubation et lavages.

tableaux

tableau 1: différentes approches diagnostiques en immunologie
évaluation du fonctionnement immun global
évaluation de la réponse immune spécifique
diagnostic indirect des infections
diagnostic direct
principe
analyser le fonctionnement normal ou rechercher un dysfonctionnement de l'immunité (déficit, tumeur, allergie, maladie auto-immune..)
recherche d'une réponse immune spécifique
recherche d'antigènes
exemples
- dosage d'Ig (sérum, colostrum..)
- recherche d'anomalies des Ig (electrophorèse es protéines plasmatiques..)
- numération-formule sanguine (nombre et aspect des leucocytes)
- palpation/radiographie des ganglions
- étude des composantes non spécifiques (fièvre/inflammation, complément (dosage, électrophorèse des protéines plasmatiques..)
- recherche de lésions auto-immunes (dépots d'anticorps: immunohistochimie..)
- sérologie des maladies infectieuses (=recherche des anticorps sériques)
- exposition contrôlée in vivo à un antigène (IDR tuberculinique, tests allergèniques..)
- détection d'antigènes microbiens ou parasitaires dans un prélèvement (sérum, fécès..)
- détection d'antigènes microbiens ou parasitaires par immunofluorescence sur une coupe tissulaire
- détection d'antigènes tumoraux solubles ou cellulaires;
- identification d'un phénotype tumoral (expression des CD membranaires)

tableau 2: quantification des techniques en immunologie

qualitative
semi-quantitative (valeur relative)
quantitative (valeur absolue)
expression du résultat positif/négatif valeur relative (ordre de grandeur, index..) qu'on peut comparer à un témoin/seuil d'interprétation de la technique valeur absolue (mg/ml, UCEE/ml, UI..) qu'on peut interpréter quelle que soit la technique
technique de mesure

2 types d'observation selon les techniques:
- résultat global (- ou +)
- analyse détaillée (ex: structures cellulaires colorées dans un test immunohistohimique..)

observation subjective de l'intensité de réaction (- à +++) méthode de titration: le même échantillon est testé à différentes dilutions (donc à des concentrations décroissantes de la substance recherchée), et on obtient une série de résultats observés.
résultat mesurable (chiffré)
extrapolation par comparaison des résultats de l'échantillon et d'une gamme "étalon" (courbe de calibration donnant en tout point une équivalence entre la mesure et la concentration de la substance recherchée)
résultat brut (densité optique, comptage de la radioactivité..) index= système d'expression du résultat qui tient compte des variations expérimentales, et permet la comparaison entre différentes séries de tests. Le résultat de l'échantillon est calculé par une formule qui tient compte des témoins index=100*(valeur brute TP-valeur brute E)/(valeur brute E-valeur brute TN).
transformation possible non on peut transformer un résultat qualitatif en un résultat relatif par la méthode de titration: Le titre est l'inverse de la dernière dilution ayant donné un résultat positif on peut transformer un résultat relatif en un résultat absolu si on compare l'échantillon testé à une référence dont le résultat est connu dans les 2 systèmes. Toutefois il s'agit d'un résultat peu précis (échelle de transformation discontinue). exemple:
- l'échantillon testé obtient le titre 32 (dilution sérielle de 2 en 2: dernier résultat positif à la dilution 1/32)
- le sérum de référence (concentration connue de 20 mg/ml d'anticorps) obtient le titre 64
- donc l'échantillon contient 2 fois moins d'anticorps que le sérum de référence, soit 10mg/ml
paramètres d'interprétation (témoins ou seuils) témoin de validité: valeur attendue d'un contrôle interne fourni avec le test (exemple: le témoin positif "doit être coloré" ou "doit présenter une DO≥0,6"..). Le test ne peut pas être interprété si le témoin de validité ne donne pas le résultat escompté (test périmé, erreur de réalisation..).
Les tests sont généralement réalisés en duplicate (2 tests par échantillon): un résultat n'est valide que si les 2 valeurs diffèrent de moins de 10-15%.
témoins d'interprétation (+ et -) : valeurs moyennes prises par des échantillons positif et négatif (ces témoins permettent de calculer les index).
Les témoins d'interprétation peuvent servir en même temps de témoins de validité.
seuil de positivité: valeur minimale que peut prendre un échantillon considéré positif.
Les tests les plus précis utilisent à la fois un seuil positif et un seuil négatif: les résultats sont positifs au delà du seuil de positivité, négatifs en dessous du seuil de négativité, "non interprétables" entre ces 2 seuils. Lorsque le résultat n'est pas interprétable, on considère l'animal suspect, et il est nécessaire de recourir à une autre méthode de test ou de refaire une analyse 1 à 2 semaines plus tard.

 


tableau 3: erreurs et critères de fiabilité du test

résultat du test: négatif résultat du test: positif causes d'erreurs fréquentes pour un test sérologique: (fig5: faux positifs et faux négatifs déterminés en fonction du seuil de positivité d'une technique)
état réel de l'animal (preuve clinique ou technique de référence) indemne VN FP (erreur par excès) présence d'anticorps interférents (immunité maternelle, vaccination..), test peu spécifique (réaction croisée avec d'autres µorganismes)
infecté FN (erreur par défaut) VP test trop précoce (incubation), test peu sensible..

2 paramètres de la qualité d'un test: sensibilité: détecter le maximum d'individus parmi les malades =VP /(FN+VP) et spécificité: détecter le minimum d'individus indemnes =VN /(FP +VN)

 

page réalisée par le Dr Delphine Grézel, VetAgro Sup, Campus Vétérinaire de Lyon, l 13/03/12-> . Merci pour les corrections, commentaires et suggestions ( delphine.grezel@vetagro-sup.fr)